Молекулярно-генетические методы — большая и разнообразная группа методов, в конечном счёте предназначенных для выявления вариаций в структуре исследуемого участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть до расшифровки первичной последовательности оснований. В основе этих методов лежат «манипуляции» с ДНК и РНК. В результате бурного развития молекулярной генетики человека в 70—80-х годах и последующего успешного изучения генома человека молекулярно-генетические методы широко вошли в медико-генетическую практику.
Чтобы познакомить с сутью и терминологией молекулярно-генетических методов, ниже схематично описаны их основные этапы и варианты. Освоение этих методов, как и других методов лабораторной диагностики, требует специальной подготовки в соответствующих лабораториях.
1. Получение образцов ДНК (или РНК) является исходным этапом всех методов. Этот этап реализуется в двух вариантах: а) выделение всей ДНК (тотальной или геномной) из клеток; б) накопление определённых фрагментов, которые предполагается анализировать, с помощью ПЦР.
Источником геномной ДНК могут быть любые ядросодержащие клетки. Выделенная из клеток ДНК представляет собой весь геном организма, поэтому такие образцы называют геномной ДНК. На практике чаще используют периферическую кровь (лейкоциты), хорион, амниотические клетки, культуры фибробластов. Для одного анализа необходимо иметь (в зависимости от используемого метода) от нескольких нанограммов до нескольких микрограммов ДНК. Для этого требуется действительно небольшое количество биологического материала, например 20—40 мг хориона, 1 мл крови, 5—10 мг культуры клеток. Для осуществления некоторых методов достаточно иметь 1 каплю крови, соскоб эпителия со щеки или несколько волосяных луковиц. Возможность проведения молекулярно-генетического анализа с небольшим количеством легкодоступного биологического материала является методическим преимуществом методов названной группы. К этому ещё можно добавить, что выделенная ДНК одинаково пригодна для проведения различных вариантов методов и может долго сохраняться в замороженном виде.
В большинстве случаев для успешной диагностики болезни или гетерозиготного состояния достаточно исследовать лишь небольшой фрагмент генома, поэтому для проведения анализа необходимо получить достаточное количество таких фрагментов, т.е. амплифицировать (умножить) их. Ранее эта задача решалась с помощью трудоёмкого подхода: создание рекомбинантной плаз-миды —> введение плазмиды в бактериальную клетку -> размножение бактериальных клеток -» выделение заданных фрагментов ДНК. Теперь эта задача — накопление нужных фрагментов ДНК — решается с помощью ПЦР. Открытие данной реакции совершило подлинную революцию в изучении генома человека и в молекулярно-генетической диагностике наследственных болезней.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод амплификации ДНК in vitro. В течение нескольких часов можно размножить определённую последовательность ДНК в количестве, превышающем исходное в миллион раз и более. Следовательно, исходно требуется очень незначительное количество материала. Необходимым условием для проведения ПЦР является знание нуклеотид-ной последовательности амплифицируемого фрагмента или по крайней мере этого фрагмента.
В соответствии с нуклеотидной последовательностью концов исследуемого участка синтезируется два олигонуклеотидных праймера (затравки). Длина праймеров составляет 20—30 пар нуклеотидов.
Процесс амплификации заключается в осуществлении повторяющихся циклов. Каждый цикл включает 3 стадии: температурная денатурация ДНК (разделение двухцепочечной ДНК на одноцепочечные молекулы) -> присоединение праймеров к комплементарным последовательностям одноцепочечных молекул (отжиг) -> синтез полинуклеотидных цепей на одноцепочечных молекулах в границах присоединенных праймеров с помощью полимеразы.
2. Рестрикция ДНК на фрагменты является необходимым этапом в молекулярно-генетической диагностике. Этот процесс осуществляется рестриктаза-ми, относящимися к группе бактериальных эндонуклеаз. В генетике человека используется несколько десятков разных рестриктаз. Основное их свойство — разрывать двухцепочечную ДНК в пределах строго определённых для каждого фрагмента последовательностей нуклеотидов протяжённостью 4—6 пар нуклеотидов (редко больше). При обработке геномной ДНК рестриктазой получается закономерный для данного фермента набор фрагментов различной длины.
3. Электрофорез фрагментов ДНК обеспечивает разделение этих фрагментов при их распределении на поверхности агарозного или полиакриламидного геля. Фрагменты ДНК движутся в геле, помещённом в постоянное электрическое поле, от отрицательного полюса к положительному в зависимости от размеров (чем больше относительная молекулярная масса фрагмента, тем медленнее он движется в электрическом поле). После окончания электрофореза каждый фрагмент ДНК занимает определённое положение в виде дискретной полосы в конкретном месте геля. Длину каждого фрагмента можно определить путём сравнения пройденного фрагментом расстояния с расстоянием, пройденным стандартным образцом ДНК с известными размерами.
4. Визуализация и идентификация фрагментов ДНК в геле является либо конечным этапом диагностики, либо необходимым элементом дальнейшего анализа.
Визуализация фрагментов ДНК после ПЦР осуществляется сравнительно легко. После окончания ПЦР проводится электрофорез в агарозном геле, после чего гель обрабатывается этидия бромидом, который связывается с ДНК. При ультрафиолетовом облучении поверхности геля выявляется свечение в красной области спектра.
Разработаны и другие методы окраски ПЦР-фрагментов. Для методов в некоторых вариантах возможна автоматическая регистрация результатов.
Идентификация конкретных фрагментов в геле среди геномной ДНК является более сложной задачей. Из-за больших размеров генома человека после рестрикции образуется настолько большое число рестриктных фрагментов, что агарозный гель после электрофореза и окраски этидия бромидом при ультрафиолетовом облучении выглядит как более или менее равномерно окрашенная поверхность. Задача генетика — выявить специфические фрагменты ДНК. Такую задачу решают с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Эта методика состоит из следующих этапов .
1. После окончания электрофореза гель помещают в раствор основания (щелочи), в котором двухцепочечные фрагменты ДНК теряют связи и становятся одноцепочечными.
2. Перенос ДНК с геля на нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр производится в буферном растворе. Непосредственно на поверхность геля кладут фильтр и стопку фильтровальной бумаги. Из-за капиллярного эффекта создаётся ток буфера, перпендикулярный плоскости геля. Вымываемая из геля ДНК задерживается фильтром и практически полностью оказывается на его поверхности. После переноса одноцепочечные нити фиксируют на фильтре. Расположение фрагментов на фильтре точно соответствует их расположению в геле.
3. Для того чтобы визуально выявить нужные фрагменты (фиксированная на фильтре ДНК не видна), проводят гибридизацию со специфическим по нуклеотидной последовательности меченым радионуклидом или флюоресцентной меткой олигонуклеотидным синтетическим зондом (такой зонд состоит из 16—30 пар нуклеотидов) либо клонированным фрагментом ДНК. Нуклео-тидная последовательность зонда должна быть полностью или частично комплементарна изучаемому участку геномной ДНК.
4. При инкубации фильтра с раствором, содержащим меченый зонд, происходит гибридизация комплементарных цепей ДНК-зонда и фрагмента на фильтре. Неспецифически связанные молекулы зонда отмываются с помощью специальной процедуры. Радиоактивно меченные участки выявляют путём экспонирования фильтра с рентгеновской плёнкой (ауторадиография). После проявления на плёнке видны полосы меченной зондом ДНК. Нерадиоактивные метки визуализируют с помощью флюоресценции или опосредованно с помощью антител.