Первое главное условие цитогенетической диагностики — наличие делящихся клеток в цитологическом препарате.
Костный мозг, ткани семенника и хорион имеют достаточный митотичес-кий индекс для того, чтобы использовать эти объекты для цитогенетических целей. Однако, как показал опыт, несравненно информативнее исследование на культурах клеток: клетки освобождены от элементов соединительной ткани и хорошо суспендируются. Митотический индекс в культуре клеток намного выше, чем в тканях организма.
Культуры клеток можно получать из кусочков кожи (растут фибробласты), костного мозга, эмбриональных тканей, хориона, клеток амниотической жидкости. Наиболее удобным объектом для медицинских генетиков оказалась культура лимфоцитов периферической крови (рис. 8.2). Для её получения достаточно взять 1—2 мл венозной крови и добавить её в смесь питательной среды с фитогемагглютинином (белок бобовых растений). Последний вызывает иммунологическую трансформацию лимфоцитов и их деление. Продолжительность культивирования составляет 48—72 ч.
Вторым методическим условием цитогенетических исследований является использование колцемида (или колхицина), разрушающего веретено деления и останавливающего клеточное деление на стадии метафазы. Колцемид добавляют в культуры клеток за 2—3 ч до окончания культивирования: митотический индекс в культуре клеток за 2—3 ч повышается в 2—3 раза. Даже без культивирования экспозиция с колцемидом увеличивает число метафаз. Хромосомы в присутствии колцемида укорачиваются за счёт продолжающейся конденсации и, следовательно, в препарате они легче отделяются одна от другой. В тех случаях, когда необходим детальный анализ определённого района хромосомы, сильно конденсированные хромосомы на стадии метафазы (метод называется метафазным) непригодны для анализа. Для этих целей клетка должна быть зафиксирована на стадии, предшествующей метафазе, когда хромосома редуплицировалась, но ещё не полностью конденсировалась. Эта стадия — стадия прометафазы. Хотя хромосомы на данной стадии плохо разъединены (они ещё очень длинные) и на препарате имеется много наложений одной хромосомы на другую, все же в отдельных клетках можно найти участок, необходимый для анализа. Этот метод (или подход) в отличие от метафаз-ного метода называют прометафазным, или методом высокоразрешающей цито-генетики. Суть методического вмешательства при данной модификации метода состоит в прекращении процесса спирализации и конденсации хромосом в профазе с помощью препаратов, которые вводят в культуру клеток за несколько часов до фиксации.
Следующим условием для получения хороших метафазных пластинок является гипотонизация клеток (гипотонический шок). Обычно для этого используют гипотонический раствор хлорида кальция или цитрата натрия. В гипотоническом растворе клетки набухают, ядерная оболочка разрывается, межхромосомные связи рвутся и хромосомы свободно плавают в цитоплазме.
На основе культивирования клеток, применения колцемида и гипотониза-ции сформировались современные цитогенетические методы.
Клеточную суспензию фиксируют смесью метанола и уксусной кислоты (3:1), затем суспензию центрифугируют и меняют фиксатор. Смесь клеток с фиксатором может сохраняться при температуре 4 °С в течение нескольких недель. При нанесении такой суспензии на чистое предметное стекло мета-фазная пластинка расправляется и в её пределах располагаются отдельно лежащие хромосомы. При высыхании фиксатора клетки прочно прикрепляются к стеклу.
Выше описана методика получения препаратов из культуры лимфоцитов, которая используется наиболее часто. В то же время для диагностических целей можно готовить препараты из хориона, костного мозга, семенников, культуры фибробластов, культуры амниоцитов. Процедуры для каждого объекта отличаются от описанной выше, но общий принцип сохраняется: накопление метафаз, гипотонизация, фиксация, раскапывание на предметное стекло.